1 背景概述

基因（Gene）是遗传信息存储的载体，而蛋白质（Protein）是生命活动中生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质能够独立的执行他的使命，但是绝大部分蛋白都是需要一些伴侣分子的协作才能完成相应的生物功能或者形成复合物之后才能充分发挥其功能功能，一般情况下有基因互作（互补/重叠/上位/隐性上位等），基因蛋白互作（最典型的转录调控），蛋白互作等形式存在。

想要深入了解细胞的生命活动，对于基因-蛋白，蛋白与蛋白之间的相互作用的认识是很有必要的，尤其是想揭示隐藏在表象下的调控机理，发表一篇比较不错的文章。说到基因，蛋白互作，就绕不开IP、co-IP、ChIP、RIP、pull-down这几个基本的实验技术。他们之间既有联系又有区别，那么今天就跟随博主一起理清它们的丝丝缕缕。

2 背景知识介绍

2.1 抗体

抗体（Antibody），免疫系统对外来物质(称为抗原（Antigen）)的反应产生的一种保护性蛋白质，抗体识别并锁定抗原，以便将其从体内清除。抗体是 B 细胞受体的分泌形式，抗体分子大致是Y形分子，由三个大小相等的分子组成，简而言之抗体是能够与特异性抗原结合的蛋白。

（图1 抗体结构示意图）

所有抗体均以相同的方式由配对的重抗体和轻抗体构建而成多肽链，通用术语免疫球蛋白用于所有这些蛋白质。这些免疫球蛋白包含五种不同类别（IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE）可以通过它们的C区来区分。以IgG（人体血清中的含量最高，占Ig总量量的75%，而且在血清中半衰期长，主要分布在血清和组织液中，是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分，也是机体抗感染免疫的过程中的重要物质基础。）为例进行说明，IgG抗体是大分子，分子量约为 150 kDa，由两种不同种类的多肽链组成。一部分大约 50 kDa，称为重链或 H 链，另一种为25 kDa，称为轻链或L链。抗体分子结构分析：通过使用木瓜蛋白酶（Protease papain）对抗体进行有限消化后抗体分子切割成三个片段（图2）。含有相同两个片段含有抗原结合活性，这些被称为Fab片段，用于 Fragment antigen binding。第三片段链接抗体分子的两个相同臂，不具备结合抗原的能力，因比较容易结晶，故称之为Fc片段（Fragment crystallizable）[1]。

（图2 抗体有限消化后观察的结构示意图）

2.2 抗原

抗原（Antigen）能够刺激免疫反应的物质，特别是激活淋巴细胞，淋巴细胞是人体对抗感染的白细胞。一般来说，抗原可分为两大类:外源抗原(或异源抗原)和自身抗原(或自身抗原)。例子包括病毒或微生物(如细菌和原生动物)的部分或产生的物质，以及蛇毒中的物质，食物中的某些蛋白质，以及来自其他人的血清和红细胞的成分[2]。

（图3 抗原-抗体-淋巴细胞相互作用示意图）

2.3 Protein A

Protein A是金黄色葡萄球菌的一种膜蛋白，是一个42 kda的蛋白，包含从N端到C端的5个同源结构域:E、D、A、B和C，其氨基酸序列由水解和酶切确定。对A蛋白的研究表明，在溶剂变性和温度变性实验中，B结构域比其他区域更稳定[3-6]。蛋白A基因包括信号序列(S)、5个IgG结合域(D、E、A、B和C)、细胞壁附着区(XM)；IgG的Fc区域的三个β旋(灰色片段，上部蛋白)和A蛋白的B区域的两个α旋(红色片段，下部蛋白)的相互作用。IgG的Fc区域的三个β旋(灰色片段，上部蛋白)和A蛋白的B区域的两个α旋(红色片段，下部蛋白)的相互作用[3]。

（图4 Protein A与抗体结构及结合示意图）

由于蛋白A对苛刻的酸性和碱性条件具有可接受的抵抗力，因此它是用于从血清和血浆基质中去除IgG以促进其他免疫球蛋白类(如IgA,

IgM, IgD和IgE)分离的最佳候选。另一方面，存在不同类型的抗体结合蛋白:蛋白A、G、L、Z和重组(融合蛋白)，它们对IgG具有不同的亲和力[7-8]。

                                         表1 最常用的细菌(融合)蛋白的一般特性[3,7-8]

表2同种类的抗体对蛋白G和蛋白A的相对结合强度在竞争性ELISA测试中测定。测定了对兔IgG与碱性磷酸酶结合抑制50%所需的IgG量[9]

2.4 Protein G

Protein G表现出比Arotein A更高的结合亲和力。它最适合在酸性pH下结合，由于其较高的结合亲和力，需要更苛刻的洗脱条件，pH 3.0或更低，这对纯化抗体的活性是有害的。通过快速中和收集的部分，这些影响可以最小化，但不能完全消除。蛋白G/IgG相互作用的强度也可导致IgG携带。为避免交叉污染，蛋白G柱应具有纯化抗体的特异性。由于保留了IgG，蛋白G在少量纯化后失去了结合能力，柱寿命较短[10-11]。

3 免疫沉淀技术（Immunoprecipitation, IP）

免疫沉淀技术原理是将可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按一定比例所形成免疫复合物，据此免疫复合物设计沉淀实验。一般是利用磁珠-Protein A或磁珠Protein G，然后再磁力架的作用下富集到磁珠上的免疫复合物从混合物中沉淀，最终将可溶性靶蛋白从磁珠上洗脱下来，进而纯化蛋白。是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质相互作用、或者蛋白质与遗传物质之间相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，也是用于抗原检测和纯化的最广泛使用的方法之一[11-12]。由IP衍生出co-IP、ChIP、RIP等，用于研究与蛋白结合的分子技术。

（图5 免疫沉淀技术操作流程示意图）

4 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, co-IP）

免疫共沉淀(co-IP)是一种流行的技术，通过使用靶蛋白特异性抗体间接捕获与特定靶蛋白结合的蛋白质，来识别生理相关的蛋白质-蛋白质相互作用。然后可以对这些蛋白质复合物进行分析，以确定新的结合蛋白、结合亲和力、结合动力学和目标蛋白质的功能。简而言之，蛋白在非变性条件下是利用抗原A与蛋白B结合，通过A的抗体沉淀A蛋白（包括互作的蛋白），再利用精制的prorein

A/G（背景知识已介绍protein A/G为什么能结合抗体）预先结合到磁珠上（一般已经商铺化，直接购买即可），使之与含有抗原（A）的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G就能吸附抗体，从而获得抗原A与蛋白B的复合体，之后就可以对B进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息[13]。

（图6 Co-IP技术操作流程示意图[13-14]）

5 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）

染色质免疫共沉淀技术（Chromatin

Immunoprecipitation，ChIP）是用来研究蛋白质与DNA是否在体内存在相互作用，常用来检测转录因子结合位点。其实就是DNA与蛋白交联固定（终止并固细胞当下生命活动状态），然后裂解细胞并把DNA打碎成200bp左右不等大小的片段，之后用IP级别抗体去捕获已知感兴趣蛋白，得到与其结合的DNA片段，然后将DNA进行纯化，之后可利用PCR、qPCR或者测序等技术进行分析DNA产物的分析和鉴定[15]。

（图7 ChiP流程示意图[15]）

6 RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein

Immunoprecipitation, RIP）

RNA是一种不稳定的生物大分子，大多数RNA需要与特定的RNA结合蛋白结合，形成RNA

/蛋白质复合物，才能在细胞中保持稳定。此外，RNA和RNA结合蛋白之间的动态关联贯穿于RNA转录合成、加工和修饰、细胞内运输和定位、功能发育和降解的整个生命周期。因此，利用RNA结合蛋白分离或发现有功能的RNA分子是RNA研究领域不可或缺的研究方法。RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)试验利用针对目的蛋白的抗体沉淀相应的RNA-蛋白复合物。分离纯化后可通过q-PCR或测序分析验证与复合物结合的RNA。RIP是一种研究细胞内RNA与蛋白质结合的技术。它是了解该网络转录后调控动态过程的有力工具，可以帮助我们发现mirna的调控靶点[16]。

（图8 RIP流程示意图[16]）

7 下拉实验（pull-down Assay）

pull-down实验是验证体外蛋白互作的主要实验手段，也是验证无成熟抗体（IP级别）的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST/HIS/MBP等（GST、HIS、MBP是最常用的标签），此处以GST（Glutathione S-transferase）为例，将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”，将细胞或者组织的总蛋白和此“诱饵蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”（当孵育后的蛋白混合液通过柱子时，能将诱饵蛋白及其相互作用的蛋白复合物捕获），最后通过洗脱的方式获得“目标蛋白”，进而预测蛋白和蛋白互作关系[17-18]。

（图9 pull-down实验流程示意图）

8 结束。

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言哲学家康德说：“请接受任何一个独立灵魂的存在，哪怕有些你并不认可，但也尽可能试着去理解。”如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击型人格请请请不要关注和阅读！！！）

参考

1.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27144/

2.https://my.clevelandclinic.org/health/diseases/24067-antigen

3.Mechanism ofantibodies purification by protein A

4.Repetitive sequencesin protein a from Staphyloccus aureus: three highly homologous Fc‐bindingregions

5. Repetitive sequencesin protein A from Staphylococcus aureus: arrangement of five regions within theprotein, four being highly homologous and fc‐binding

6. Covalentimmobilization of protein A on chitosan and aldehyde double-branched chitosanas biocompatible carriers for immunoglobulin G (igg) purification

7. Immunogenic andantigenic epitopes of immunoglobulins—VII. The topographical distribution ofFcγ epitopes and the relationship of an iso-allotypic specificity to thepresence of histidine 435

8. Immunoglobulin G:functional sites

9.https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/technical-documents/technical-article/protein-biology/protein-pulldown/protein-a-g-binding

10. Gagnon P (1996).Purification tools for monoclonal antibodies (Tucson: Validated BiosystemsInc).

11.https://www.bio-rad.com/zh-cn/applications-technologies/protein-g-affinity?ID=LUSMML97Q#:~:text=Protein%20G%20exhibits%20a%20higher%20binding%20affinity%20than,detrimental%20to%20the%20activity%20of%20the%20purified%20antibody.

12. https://zhuanlan.zhihu.com/p/502864781

13. Analysis ofProtein–Protein Interaction by Co-IP in Human Cells

14. https://www.activemotif.com.cn/catalog/25/nuclear-complex-co-ip-kit

15.https://blog.benchsci.com/chromatin-immunoprecipitation-chip-principles-and-how-to-obtain-quality-results

16.https://www.creativebiomart.net/resource/principle-protocol-rna-binding-protein-immunoprecipitation-rip-380.htm

17. https://zhuanlan.zhihu.com/p/609028272

18. https://zhuanlan.zhihu.com/p/250279081